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产品及应用

重组酶产品

Cre-LoxP系统策略是进行基因组定点突变的新途径,可在DNA的特定位点上执行敲除、插入、激活、倒转及易位等。Cre-LoxP系统包括Cre重组酶和LoxP位点两个部分。Cre重组酶是整合酶家族的一员,从大肠杆菌噬菌体P1中发现,是最常用的位点特异性DNA重组酶。Cre基因有1029个碱基,Cre重组酶由343个氨基酸组成(约38kD),它不仅具有催化活性,而且跟限制酶相似,识别特异的DN A序列,如:loxP位点,引起重组。Cre重组酶有70%的重组效率,不借助任何辅助因子,可作用于多种结构的DNA底物,如线形、环状甚至超螺旋DNA。loxP位点是Cre重组酶作用的特异性重组位点,由两个13 bp的反向重复序列和8 bp的间隔序列构成,长34 bp,具体序列如下:5’一ATAACTTCGTATA一GCATACAT一TATACGAAGTTAT一3’ 或3’一TATTGAAGCATAT一CGTATGTA一ATATGCTTCAATA一5’。两个反向重复序列是Cre的识别序列,中间的间隔序列是重组发生的位置,同时也决定了loxP位点的方向,根据loxP序列的排列方向产生不同的重组结果。


图1. Cre重组酶结合的loxP位点


原理

Cre-loxP系统存在以下几种诱导重组的方式,这是基于Cre重组酶与loxP位点的相互作用而实现的。当基因内存在loxP位点且有Cre重组酶存在时,Cre重组酶便会与loxP位点两端的反向重复序列区结合形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合,进而形成四聚体。随之,loxP位点之间的DNA序列被Cre重组酶切掉,切口通过DNA连接酶重新连接。DNA重组结果主要取决于loxP位点的方向及位置。


Cre重组酶介导的两个loxP序列间的特异性重组根据序列位置和方向的不同分为三种情况:①当两个loxP序列位于同一条DNA链且方向相同时,Cre重组酶能够敲除两个loxP序列间的DNA片段;②当两个loxP序列位于同一条DNA链且方向相反时,Cre重组酶能够反转两个loxP序列间的DNA片段;③当两个loxP序列位于不同DNA链上时,Cre重组酶能够介导loxP序列间DNA链的交换或染色体易位。Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程。

图2. Cre-loxP系统诱导基因重组的方式

Cre-loxP系统的优点

1. 高效性;

Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片段形成复合物之后,可以快速引发DNA重组,不受靶基因大小和位置的影响。

2. 时空特异性;

可以特定时间实现体内特定种类器官或组织中的基因敲除,避免了某些基因完全敲除所导致的胚胎致死效应。

3. 应用范围广。

真核及原核均适用,不同组织、不同生理条件下均可起作用。

Cre-loxP系统的进展

对Cre元件的改造:在Cre元件的C端接上雌激素受体(ER)的配体结合结构域,为了避免体内雌激素的干扰,可对雌激素受体的配体结合区做一定程度的改变,使其只能和某些雌激素衍生物相结合。目前使用最多的是Cre-ERT2突变体,融合蛋白Cre-ERT2不能入核,定位在胞浆内,当雌激素衍生物他莫昔芬结合到Cre-ERT2受体结合结构域后,蛋白才会通过构象变化从锚定蛋白HSP90上解离下来,进入细胞核,识别loxP位点并发生重组。通过控制他莫昔芬的注射时间,就可以调控基因重组的时间特异性。

图3. 他莫昔芬诱导的Cre-ER系统(Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res. 2018)


1.对loxP元件的改造:loxP元件也可以在间隔区和回文序列进行突变,不同的碱基选择就造就了不同的lox位点,常见的有lox2272、lox511、lox5171、loxN和loxP等。突变后的loxP序列和同样突变的loxP序列匹配,才能被Cre重组酶识别和重组,而不能和未突变的loxP序列匹配,这样就可以将不同的loxP序列组合用于控制多个基因,在Cre重组酶的作用下,实现多个基因的重组。Brainbow技术就是根据loxP序列的改造而实现的。


2.四环素诱导型tetO-Cre:将四环素调控系统与Cre-loxP系统相结合,需要用两种转基因小鼠交配使用。一种是由四环素响应启动子元件(TRE,也叫tetO)控制的Cre工具鼠(TRE-Cre,也叫tetO-Cre);另一种是由组织特异性启动子驱动的表达四环素转录活化因子tTA或rtTA的小鼠。tTA或rtTA与tetO的结合受四环素或其衍生物多西环素(Dox)的调节。tTA在没有Dox的时候与tetO结合诱导Cre表达,有Dox的时候不能与tetO结合,Cre不表达;rtTA与tTA相反,有Dox的时候与tetO结合,诱导Cre表达,没有Dox的时候与tetO不结合,Cre不表达。因此可以通过Dox来调控Cre在特定时间及特定组织细胞中的表达,从而介导基因重组。

图4. 四环素诱导型tetO-Cre(Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res. 2018)

产品列表

功能描述 产品编号 产品名称
Cre重组酶 PT-0220 PFD-rAAV-CaMKIIa-CRE
PT-0136 rAAV-hSyn-CRE
PT-0888 PFD-rAAV-EF1α-CRE
PT-0143 rAAV-EF1α-NLS-CRE
PT-0025 rAAV-CMV-CRE
PT-0137 rAAV-CaMKIIa-EGFP-P2A-CRE
PT-1168 rAAV-hSyn-CRE-EGFP
PT-0156 rAAV-hSyn-GFP-P2A-CRE
PT-0407 PFD-rAAV-hSyn-CRE-mCherry
PT-0343 PFD-rAAV-EF1α-EGFP-P2A-CRE
PT-0253 rAAV-CMV-EGFP-P2A-CRE
PT-0368 PFD-rAAV-CMV-CRE
PT-0834 rAAV-CMV-CRE-Flag
PT-0134 rAAV-CMV-βGlobin-CRE-3XFlag
PT-0198 PFD-rAAV-CaMKIIa-EGFP-P2A-CRE
PT-1399 rAAV-hSyn-CRE-P2A-EGFP
PT-0789 rAAV-hSyn-fDIO-CRE-mCherry
Flp重组酶 PT-0144 rAAV-EF1α-FLP
PT-0075 rAAV-EF1α-DIO-FLP
PT-0311 rAAV-CAG-DIO-FLP
PT-1115 PFD-rAAV-CaMKIIa-FLP
PT-0341 PFD-rAAV-hSyn-FLP
PT-0026 rAAV-CMV-FLP-hGH polyA
PT-0369 PFD-rAAV-CMV-FLP
PT-0668 rAAV-CaMKIIa-FLP-EGFP
PT-0285 rAAV-EF1α-DIO-FLP-P2A-mCherry
PT-0557 rAAV-CAG-DIO-WGA-FLP

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